IPTG (আইসোপ্রোপাইল-β-D-থিওগ্যালাক্টোসাইড) হলো β-গ্যালাক্টোসিডেজ সাবস্ট্রেটের একটি অ্যানালগ, যা অত্যন্ত ইন্ডুসিবেল। IPTG-এর ইন্ডাকশনের অধীনে, ইন্ডুসারটি রিপ্রেসর প্রোটিনের সাথে একটি কমপ্লেক্স গঠন করতে পারে, যার ফলে রিপ্রেসর প্রোটিনের কনফরমেশন পরিবর্তিত হয়, যার কারণে এটি টার্গেট জিনের সাথে যুক্ত হতে পারে না এবং টার্গেট জিনটি দক্ষতার সাথে প্রকাশিত হয়। তাহলে পরীক্ষার সময় IPTG-এর ঘনত্ব কীভাবে নির্ধারণ করা উচিত? পরিমাণ যত বেশি হবে, তত কি ভালো?
প্রথমে, আসুন IPTG আবেশনের মূলনীতিটি বুঝি: ই. কোলাই-এর ল্যাকটোজ অপেরন (উপাদান)-এ Z, Y, এবং A নামক তিনটি গঠনমূলক জিন থাকে, যেগুলো যথাক্রমে β-গ্যালাক্টোসিডেজ, পারমিয়েজ, এবং অ্যাসিটাইলট্রান্সফারেজ এনকোড করে। lacZ ল্যাকটোজকে হাইড্রোলাইজ করে গ্লুকোজ ও গ্যালাক্টোজ, অথবা অ্যালো-ল্যাকটোজে পরিণত করে; lacY পরিবেশ থেকে ল্যাকটোজকে কোষঝিল্লি ভেদ করে কোষে প্রবেশ করতে দেয়; lacA অ্যাসিটাইল-CoA থেকে অ্যাসিটাইল গ্রুপকে β-গ্যালাক্টোসাইডে স্থানান্তর করে, যার মাধ্যমে বিষাক্ত প্রভাব দূর করা হয়। এছাড়াও, একটি অপারেটিং সিকোয়েন্স O, একটি স্টার্টিং সিকোয়েন্স P এবং একটি নিয়ন্ত্রক জিন I রয়েছে। I জিনটি একটি রিপ্রেসর প্রোটিন কোড করে যা অপারেটর সিকোয়েন্সের O অবস্থানে যুক্ত হতে পারে, যার ফলে অপেরনটি (মেটা) দমন ও বন্ধ হয়ে যায়। প্রারম্ভিক ক্রম P-এর উজানে ক্যাটাবলিক জিন অ্যাক্টিভেটর প্রোটিন-CAP বাইন্ডিং সাইটের জন্যও একটি বাইন্ডিং সাইট রয়েছে। P ক্রম, O ক্রম এবং CAP বাইন্ডিং সাইট একত্রে ল্যাক অপেরনের নিয়ন্ত্রক অঞ্চল গঠন করে। জিন উৎপাদসমূহের সমন্বিত অভিব্যক্তি অর্জনের জন্য তিনটি এনজাইমের কোডিং জিনগুলো একই নিয়ন্ত্রক অঞ্চল দ্বারা নিয়ন্ত্রিত হয়।
ল্যাকটোজের অনুপস্থিতিতে, ল্যাক অপেরন (মেটা) একটি দমন অবস্থায় থাকে। এই সময়ে, PI প্রোমোটার সিকোয়েন্সের নিয়ন্ত্রণে I সিকোয়েন্স দ্বারা প্রকাশিত ল্যাক রিপ্রেসর O সিকোয়েন্সের সাথে আবদ্ধ হয়, যা RNA পলিমারেজকে P সিকোয়েন্সের সাথে আবদ্ধ হতে বাধা দেয় এবং ট্রান্সক্রিপশন শুরু হওয়াকে প্রতিহত করে; যখন ল্যাকটোজ উপস্থিত থাকে, তখন ল্যাক অপেরন (মেটা) প্ররোচিত হতে পারে। এই অপেরন (মেটা) সিস্টেমে, আসল প্ররোচক ল্যাকটোজ নিজে নয়। ল্যাকটোজ কোষে প্রবেশ করে এবং β-গ্যালাক্টোসিডেজ দ্বারা অনুঘটকীয়ভাবে অ্যালোল্যাকটোজে রূপান্তরিত হয়। পরবর্তীকালে, এটি একটি প্ররোচক অণু হিসাবে রিপ্রেসর প্রোটিনের সাথে আবদ্ধ হয় এবং প্রোটিনের গঠন পরিবর্তন করে, যা O সিকোয়েন্স এবং ট্রান্সক্রিপশন থেকে রিপ্রেসর প্রোটিনের বিচ্ছিন্নতার দিকে পরিচালিত করে। আইসোপ্রোপাইলথিওগ্যালাক্টোসাইড (IPTG)-এর প্রভাব অ্যালোল্যাকটোজের মতোই। এটি একটি অত্যন্ত শক্তিশালী প্রবর্তক, যা ব্যাকটেরিয়া দ্বারা বিপাকিত হয় না এবং খুব স্থিতিশীল, তাই এটি গবেষণাগারে ব্যাপকভাবে ব্যবহৃত হয়।
IPTG-এর সর্বোত্তম ঘনত্ব কীভাবে নির্ধারণ করা যায়? ই. কোলাইকে উদাহরণ হিসেবে নিন।
পজিটিভ রিকম্বিন্যান্ট pGEX (CGRP/msCT) ধারণকারী E. coli BL21 জেনেটিক্যালি ইঞ্জিনিয়ারড স্ট্রেইনটিকে ৫০μg·mL-1 Amp যুক্ত LB তরল মাধ্যমে ইনোকুলেট করা হয়েছিল এবং ৩৭°C তাপমাত্রায় সারারাত ধরে কালচার করা হয়েছিল। সম্প্রসারণ কালচারের জন্য, উপরোক্ত কালচারটিকে ১:১০০ অনুপাতে ৫০μg·mL-1 Amp যুক্ত ৫০mL তাজা LB তরল মাধ্যমের ১০টি বোতলে ইনোকুলেট করা হয়েছিল, এবং যখন OD600-এর মান ০.৬~০.৮ ছিল, তখন IPTG চূড়ান্ত ঘনত্বে যোগ করা হয়েছিল। এর ঘনত্বগুলো হলো ০.১, ০.২, ০.৩, ০.৪, ০.৫, ০.৬, ০.৭, ০.৮, ০.৯, ১.০mmol·L-1। একই তাপমাত্রা ও একই সময়ে আবেশনের পর, তা থেকে ১ মিলি ব্যাকটেরিয়া দ্রবণ নেওয়া হয় এবং সেন্ট্রিফিউগেশনের মাধ্যমে ব্যাকটেরিয়া কোষগুলো সংগ্রহ করে প্রোটিন এক্সপ্রেশনের উপর বিভিন্ন IPTG ঘনত্বের প্রভাব বিশ্লেষণ করার জন্য SDS-PAGE করা হয়, এবং তারপর সর্বাধিক প্রোটিন এক্সপ্রেশনযুক্ত IPTG ঘনত্বটি নির্বাচন করা হয়।
পরীক্ষার পর দেখা যাবে যে, IPTG-এর ঘনত্ব যতটা সম্ভব বেশি হওয়া উচিত। এর কারণ হলো, ব্যাকটেরিয়ার জন্য IPTG-এর একটি নির্দিষ্ট বিষাক্ততা রয়েছে। ঘনত্ব অতিক্রম করলে তা কোষকেও মেরে ফেলে; এবং সাধারণত আমরা আশা করি যে কোষে যত বেশি দ্রবণীয় প্রোটিন তৈরি হবে, ততই ভালো, কিন্তু অনেক ক্ষেত্রে যখন IPTG-এর ঘনত্ব খুব বেশি হয়, তখন প্রচুর পরিমাণে ইনক্লুশন তৈরি হয়, কিন্তু দ্রবণীয় প্রোটিনের পরিমাণ কমে যায়। তাই, সবচেয়ে উপযুক্ত IPTG ঘনত্ব প্রায়শই বেশি হলে ভালো হয় না, বরং ঘনত্ব যত কম হয়, ততই ভালো।
জিনগতভাবে পরিবর্তিত স্ট্রেইনের ইন্ডাকশন এবং কালটিভেশনের উদ্দেশ্য হলো টার্গেট প্রোটিনের উৎপাদন বৃদ্ধি করা এবং খরচ কমানো। টার্গেট জিনের এক্সপ্রেশন শুধুমাত্র স্ট্রেইনের নিজস্ব ফ্যাক্টর এবং এক্সপ্রেশন প্লাজমিড দ্বারাই প্রভাবিত হয় না, বরং অন্যান্য বাহ্যিক পরিস্থিতি, যেমন ইন্ডুসারের ঘনত্ব, ইন্ডাকশন তাপমাত্রা এবং ইন্ডাকশন সময় দ্বারাও প্রভাবিত হয়। তাই, সাধারণত, কোনো অজানা প্রোটিন এক্সপ্রেস এবং পিউরিফাই করার আগে, উপযুক্ত পরিস্থিতি নির্বাচন করতে এবং সর্বোত্তম পরীক্ষামূলক ফলাফল পেতে ইন্ডাকশন সময়, তাপমাত্রা এবং IPTG-এর ঘনত্ব নিয়ে গবেষণা করা সবচেয়ে ভালো।
পোস্ট করার সময়: ৩১ ডিসেম্বর, ২০২১